論文標題：Seasonal Characterization of the Endophytic Fungal Microbiome of Mulberry (Morus spp.) Cultivars Resistant and Susceptible to Sclerotiniosis（桑樹菌核病抗病品種和感病品種的內生真菌微生物群落的季節特征）

期刊：Microorganisms

作者：Weifang Xu et al.

發表時間：28 September 2021

DOI：10.3390/microorganisms9102052

微信鏈接：

https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI1MzEzNjgxMQ==&mid=2650053776&idx=2&sn=

780ab9bba2538c719faafdf3b742aa80&chksm=f1d92654c6aeaf426c8d4b12d0fc5a847f

c73d23f0168276c719a71fe5b0c71a2114c79f8bff&token=1792528896&lang=zh_CN#rd

期刊鏈接：

https://www.mdpi.com/journal/microorganisms

原文作者介紹

向仲懷 中國工程院院士

西南大學蠶學與系統生物學研究所所長、蠶學遺傳育種專家、國家蠶桑產業技術體系首席科學家。向院士長期從事蠶業教育和科學研究，主持建立了中國第一個家蠶基因庫，2003年領導完成世界第一張家蠶基因組框架圖，2006年領導完成家蠶基因組精細圖和全基因組基因芯片；研究發現四川省災害性蠶病壁虱病病源，為該病的有效防治解決了關鍵問題；經年研究至今，以家蠶基因組為基點，對相關物種的轉基因選擇、性狀表達機制、抗菌抗病等做出了先進的指導性研究。近年，向院士同步開展了針對作為家蠶的獨特食物來源的桑樹的研究。

文章導讀

植物內生菌群在促進植物生長和健康方面起著重要的作用。本研究采用非培養和純培養兩種方法，研究了四個桑葚菌核病抗性不同的桑樹品種 (抗病/感病品種) 的內生真菌群落在不同季節 (春季/秋季) 的差異。核心內生菌群按季節分為兩組，春季樣品中具有較多操作分類單元 (OTUs) 和α-多樣性，而秋季樣品中具有較多的真菌綱Dothideomycetes的序列或分離物。通過比較不同的桑樹品種，發現感病品種的OTUs總數高于抗病品種，且均存在枝孢菌。值得注意的是，菌核病 (sclcleromitrula shiraiana) 的致病因子僅在感病品種中檢測到。結果表明，桑樹內生菌群的變化主要與季節變化有關，其次與桑樹品種對菌核病的抗性水平有關。

研究過程

1 樣品采集和處理

采集8個桑樹分枝樣品 (2個季節×4個品種)，其中CG、CQ為菌核病抗病品種，HG、XL為感病品種，分別采于春季 (2016年4月) 和秋季 (2016年9月)。

2 內生菌富集

從每個樣品中隨機選擇10個滅菌片段，并混合作為一個重復單元進行內生菌富集。所有樣品均進行3次重復處理。

3 DNA提取、ITS基因測序及內生真菌的培養

利用引物擴增內部轉錄間隔層 (ITS)，根據其BLAST結果進行屬水平鑒定和分類。

4 生物信息學與統計分析

為了比較不同桑樹樣品中真菌群落結構的差異，并考慮到品種和季節對其的影響，建立8個類群和4個僅考慮品種因素的分組。

研究結果

1 基于ITS擴增子序列的內生真菌多樣性研究

經過質量控制、篩選、測序分析獲得803,114條高質量序列。在2個季節× 4個品種× 3次重復的24份DNA樣本中，序列相似性高達97%的OTUs總數有1038個。計算發現無論哪個品種，春季樣品中真菌OTUs的α-多樣性都高于秋季樣品 (圖1)。對不同品種而言，感病品種的豐富度和多樣性在春季樣品中高于抗性品種，而在秋季樣品中則不明顯。結果表明，季節對內生真菌群落多樣性影響較大，其次是寄主品種。

圖1. 春、秋季4個桑樹品種內生真菌群落的α-多樣性分析 (A) Sobs；(B) Chao；(C) Shannon；(D) Simpson。x軸表示桑樹品種，y軸表示不同指標的OTU豐度觀測值。每個樣品n = 3。

2 內生真菌的分類組成

測序結果顯示，子囊菌門是所有樣品中的優勢菌門，其次是擔子菌門，其余OTUs未被分類 (圖2)。在子囊菌門中，OTUs主要被鑒定為Dothideomycetes和Sordariomycetes。Dothideomycetes主要包括Capnodiales和Pleosporales。Sordariomycetes僅以Hypocreales為代表。此外，Capnodiales以枝孢霉屬為主。

基于純培養法，從所有樣品中共獲得109株分離菌株，包括1門、3綱、10目、13科、19屬。在門水平上，所有分離菌都屬于子囊菌門。分離菌包含3個綱，Dothideomycetes、Sordariomycetes和Eurotiomycetes。優勢目包括: Hypocreales、Pleosporales和Capnodiales。主要屬包括Cladosporium sp.和Fusarium sp.?？傮w而言，桑樹核心內生菌群易于分離和培養。

圖2. 春、秋季4個桑樹品種的內生真菌門的相對豐度。x軸表示不同樣本的菌群，y軸為總菌群的相對豐度。

3 內生真菌群落在春季和秋季的差異

PCoA和聚類分析均表明，春季和秋季樣品的真菌群落存在顯著差異。真菌OTUs的數量由春季813個下降到秋季652個。組合樣品中特有的OTUs數量也從春季386個下降到秋季225個。此外，群落組成分析表明，春季樣品中的優勢真菌門-子囊菌門為59.61%，而在秋季樣品中增加至75.96%。在春季和秋季樣品中擔子菌門分別為9.96和5.41%?？傊?，內生真菌群落在不同季節的組成和分布均不相同。

4 四個桑樹品種內生真菌組成的比較分析

無論季節的影響如何，觀察到的真菌OTUs總數在XL中最高，其次是HG、CG和CQ。感病品種共有的OTUs數量 (HG、XL) 遠高于抗病品種 (CQ、CG)。此外，感病品種XL特有的OTUs數量高于HG，而抗病品種CG高于CQ。在門和綱水平上，4個品種的真菌群落無明顯差別。在目水平上則存在一定差異。結果分析表明，感病品種中各類群的相對豐度是相似的，而抗病品種中存在著顯著的差異。

5 季節對菌核病抗性不同的桑樹內生真菌組成影響

相對于春季樣品，HG、XL和CQ在秋季樣品特有的OTUs數量明顯減少。在CG中，春季樣品和秋季樣品特有的OTUs數量幾乎相同，共有的OTUs數量在4個品種中最高 (圖3A)。PCoA分析也表明，兩個季節的樣品間存在較大差異?？偟膩碚f，季節變化對桑樹真菌群落的組成起著至關重要的作用，而CG的真菌群落則具有相對的穩定性 (圖3B)。

圖3. 4個桑樹品種春、秋季樣品的內生真菌豐富度比較。(A) 春季和秋季OTUs數量的維恩圖。不同顏色代表不同樣品組。數值表示OTUs數量。(B) PCoA分析。每個樣品n = 3。

另外，基于非培養法，研究者發現Scleromitrula shiraiana僅在感病品種 (SH、SX) 中被鑒定出來，而通過純培養法則未發現其分離株，這可能與該屬的豐度較低有關。上述結果表明，菌核病病原體僅存在于春季感病品種的內生真菌群落中。

研究結論

采用高通量測序和純培養法，對4個抗性不同的桑樹品種在春、秋季的內生真菌群落進行了研究。結果表明，不同桑樹品種之間的群落組成和多樣性存在顯著差異，主要受季節變化影響，其次受寄主基因型影響。此外，桑樹品種的抗性可能在一定程度上影響病原菌的定殖。

本研究拓寬了我們對桑樹微生物群落調節因子的認識，并為桑樹內生菌作為生物防治劑在提高抗性和促進生長方面提供了重要依據。

Microorganisms期刊介紹

主編：Martin Von Bergen, Department of Molecular Systems Biology, Helmholtz Centre for Environmental Research—UFZ, Germany

期刊主題涵蓋微生物學的各個研究領域，重點刊載環境、植物、食品、腸道、醫藥、技術等微生物相關領域的學術文章?，F已被SCIE (Web of Science)、PubMed (NLM)、Scopus等重要數據庫收錄。

2020 Impact Factor：4.128

Time to First Decision：15 Days

Time to Publication：33 Days